元至正十五年（公元1355年），朱元璋率领大军渡江，马氏和将士的家眷仍留在和州（今安徽和县）。当时长江交通线被元军切断，和州孤立，马氏鼓励将士，抚慰眷属，稳定后方。攻下集庆（今南京市）以后，由于战争的需要，她还亲手为将士缝衣做鞋。元至正二十年（公元1360年），陈友谅率兵东下，直逼江宁（今江苏省南京市郊），朱元璋亲自领兵抵御。强敌兵临城下，城中的官员、居民有的打算逃难，有的忙着窖藏金银，囤积粮食。马氏却镇静自若，把自己的金帛全都拿出来犒赏士兵，稳定了军心，为朱元璋获得胜利起了重要作用。
　　位居皇后
　　1368年（洪武元年）正月，朱元璋登基于应天府（今南京），国号大明，建元洪武，册封马氏为皇后。
　　马皇后有五子，其中朱橚最为年幼，性格放荡不羁，长大后被封到开封做周定王。马皇后对他极不放心，周定王临行时，便派江贵妃随往监督，还把自己身上的旧布衣脱下来交给江贵妃，并赐木杖一根嘱咐：“周定王有过错，可以披衣杖责。如敢违抗，驰报朝廷。”从此一见着慈母的旧布衣，周王便生出敬畏之情，不敢胡作非为。以严为爱是马皇后对待子女的原则。对宁国公主、安庆公主，马皇后也要求她们勤劳俭朴，不能无功受禄。而对待朱元璋的义子沐英、李文忠等，她慈爱有加，细心照顾视为己出。
　　诸王的师傅李希颜因一小王顽皮不听话，常用体罚惩治。一天，李希颜用笔管戳了一下一个小王的额角，小王便哭着到朱元璋处诉苦。元璋大怒，正要发作，马皇后急忙从旁劝解说：“乌有以圣人之道训吾子，顾怒之耶！”朱元璋觉得有理，不但没有惩办希颜，反而提升他做左春坊右赞善。
　　后宫典范
　　马皇后虽贵为皇后，每天仍亲自操办朱元璋的膳食，连皇子
　　明太祖孝慈皇后
　　明太祖孝慈皇后
　　皇孙的饭食穿戴，她也亲自过问，无微不至宫人或被幸得孕，马皇后倍加体恤，嫔妃或忤上意，马皇后则设法从中调停。
　　马皇后在内宫的治理工作上“讲求古训”，并注意借鉴前朝的经验。她觉得宋朝有许多贤惠的皇后，便命女史摘录她们的家法，经常翻阅查看。有人说，宋朝的皇后太过仁厚了吧？马皇后反问道：“过于仁厚，难道不比刻薄更好吗？”有一天，皇后问女史：“黄老之学是什么，汉朝的窦太后却非常地喜欢？”女史说：“黄老之学把清静无为作为根本。像弃绝仁义，让老百姓注重孝顺友爱，这就是它的教义。”马皇后说：“孝顺友爱就是仁义，难道有让人弃绝仁义却去讲究孝顺友爱的吗？”
　　马皇后也设法保护宫女，朱元璋曾经非常生气地责备宫人，马皇后也假装生气，让人送到宫正司定罪。朱元璋说：“为什么？”马皇后说：“作帝王的不因喜怒而随意的赏罚。当您生气的时候，恐怕有所偏重。交付到宫正司，就能判定的比较合理了。也就是说陛下您定人罪也应该交付到有关的部门罢了。”
　　马皇后勤俭持家、 以身作则，平常穿的衣服，洗了又洗，早已破旧不堪，也不愿换新的。后来听了元世祖的察必皇后煮弓弦织帛衣的故事，大受启发。就命人在后宫架起织布机，亲自织些绸衣料、缎被面什么的，然后以皇家献爱心的名义赐给那些年纪大的孤寡老人。而剩余的布料，马皇后则裁成衣裳，赐给王妃公主，并解释说：”你们生长在富贵家庭，不知纺织的难处，要爱惜财物。“
　　爱民如子
　　朱元璋在前殿处理事情，有时非常生气，马皇后等朱元璋回到后宫，常常依据事理委婉地劝阻。朱元璋的性格虽然刚毅，但因为马皇后的劝阻而能够减免刑罚的人也有很多。
　　参军郭景祥守卫和州，有人告密说他的儿子拿着槊想杀他的父亲，朱元璋听后大怒，想要杀了郭景祥的儿子。马皇后说：“郭景祥只有一个孩子，别人告密的也许不是实际情况，杀了他恐怕就会断绝郭景祥的后代。”朱元璋认真了解情况后，发现他果然是冤枉的。
　　朱元璋的义子李文忠守卫严州，杨宪诬告他不遵守法律，朱元璋想召李文忠回来。马皇后说：“严州，是面临敌境的地方，随便的更换将领不合适。况且李文忠向来贤明，杨宪的话难道可以相信吗？”朱元璋于是停止了这件事。李文忠后来终于建立了大功。

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